显微荧光光谱成像系统的组成

显微荧光光谱成像系统（MFSIS）包括以下几个部分：光源，分光系统，荧光显微镜，图像适配器，高性能制冷CCD摄像器件，图像采集卡，图像生成与处理、图像显示等，系统结构如图1所示。

图1   显微荧光光谱成像系统结构

工作过程：高功率单色激发光源激发显微镜下样品，使之发射出特定的生物荧光.依据Stocks定律，荧光波长大于激发光波长，采用光谱分光元件可以从光谱上将二者分开。在系统中可以通过对线性可变单色滤光片LVF的精确位移控制实现光谱分辨。通过LabVIEW软件控制系统硬件改变其位置，并触发图像采集系统同步工作，即可获取序列图像—光谱图像立方体。采集图像信号并进行处理后，就能够获取微区荧光光谱扫描谱图的详细信息。使用在NI视觉开发模块的基础上所开发的显微荧光光谱分析软件能够对采集来的图像进行相关图像处理与光谱信息分析。

显微荧光光谱成像系统主要有三大功能模块构成：基于LVF的分光系统控制模块、序列图像采集模块和光谱图像处理与分析模块。

分光系统控制模块

    光谱仪器的核心部分是色散系统，这是因为光谱仪器的四个最主要的基本特征即工作光谱范围、色散率、分辨率和集光本领都决定于色散系统。本系统采用美国OCEAN公司的线性可变滤光片(LVF)作为色散元件，实现光谱阻断或者通过。

分光系统的软件部分主要是利用LabVIEW的串口工具来控制LVF的运动。主要功能包括：

※ 系统复位

※ 往复运动与指定波长位置

※ 步进工作：按照给定的间隔步长，由按键控制电机步进

※ 行程控制与精确定位

软件系统中的控制窗口如图2所示。运行时的操作过程为：给定set value的值，电机可以直接运行到指定的波长值，并且在current wavelength处实时显示当前波长，然后根据给定的step值，点击step按钮，进行电机的步进。根据需要，可以随时进行中断并复位。运行过程中，通过busy指示灯控件反映运行的信息，当程序运行正常时，指示灯闪烁，提示等待信息；当程序发现错误时，指示灯停止闪烁，提示栏会提示错误原因。以便及时更正错误信息。

图2  分光系统的控制

序列图像采集模块

显微序列图像的采集采用了美国Pixera公司的150CL型高性能冷CCD，配备图像采集卡，但是该卡无LabVIEW驱动程序。本文中利用LabVIEW的DLL动态函数调用功能，通过对Pixera公司提供控制SDK包的调用，实现了图像采集的曝光时间设置、自动增益调节、自动对焦、积分时间调整、黑/白平衡、彩色/灰度切换以及CCD灵敏度设置等多项功能。本文设计了图像采集的必备子VI，其中包括CCD驱动、图像灵敏度、制冷控制、荧光快速模式等，并将CCD采集到的图像数据自动存入一临时文件，采用ReadFile子VI，读取该JPEG格式的图像文件，显示在位于面板右侧的图片显示区中。

除采用软件控制外，通过一个手动按钮控件。控制采集卡的图像CCD采集工作，自动完成图像数据采集、存储和显示。此系统工作简便，快速，实时性强，能够很好地配合整个系统工作。

光谱图像模块

    显微荧光光谱曲线的绘制是本系统的特点之一。如图3所示，经过光谱扫描得到的序列图像形成光谱立方体，其中从第0幅图到第i幅图分别对应不同的波长值，居于图像中心的像素波长值分别为：λ00，λ00，……，λ0i。对于每幅图象任意像素点，通过光谱计算可以确定其对应的波长值和光强度值，由此实现绘制图像上任意点的光谱曲线。

图 3  序列图像的光谱构成

以下以FluorCell#2荧光分子探针显微荧光光谱成像为例。首先在镜下调整成像的照明、CCD灵敏度、手动调焦，选择需要细节观察的细胞区域。然后设定光谱立方体所需要的荧光采集参数、波长步进值、图像内存区、光谱分光速度等，启动序列图像采集，系统将自动按照设定波长获取相应的光谱图像序列，并将之存储在指定目录下，该目录自动设定为当前年月日时分，采集完成后可按照要求更改。系统工作界面如图4：

图４　Fluorcell#2的光谱图像采集

完成图像立方体采集后，选择任意波长图像上感兴趣的一个区域，然后通过计算，以该区域上每个像素点的强度中值或平均值为纵坐标，波长值为横坐标，便绘制出了光谱曲线，也称为“面域光谱”，如上图中右下角曲线中的白点。所选定的区域还会被标记在系统的显示面板上。

此外，考虑到图像立方体中图像的个数有限，容易造成曲线的不平滑。所以，我们对光谱曲线进行拟合，采用三次样条内插的方法，使整个曲线看起来更加平滑。如图中右下方的曲线中红线。

除光谱曲线绘制的功能外，软件还增加了一些基本的图像处理功能，用来针对图像立方体中某一幅图像进行处理。主要有以下功能：彩色图像显示，RGB直方图，RGB阈值分割，灰度图显示，三维图，反相图，图像增强（图像均衡化，低通滤波，高斯滤波，平滑滤波），边缘锐化（拉普拉斯），灰度直方图，灰度阈值滤波，面积计算与统计，直线强度分布图。此外，为了方便对图像立方体中图像的整体了解，本系统设置了图像的Flash显示。即，按照一定的时间间隔，顺序显示多光谱图像。从效果来看，类似动画播放，使观察者对图像上目标的动态信息变化有更好地了解。这种方法同样可以应用于细胞形态变化的观察。

应用实验

1．栀子提取物抗病毒性研究

中药栀子性味苦寒、归心肺三焦经，能泻火除烦、清热利尿、凉血解毒，具通泻三焦火邪的功效，是中医药用于治疗温毒疫病的要药。病毒感染特性：病毒的感染有赖于病毒吸附蛋白(virus attachment protein，VAP )对细胞表面受体的吸附。病毒吸附蛋白是启动病毒与宿主细胞之间相互作用、建立感染损伤细胞的必然途径。

病毒与细胞受体的结合可以用荧光标记，将培养的人喉癌上皮传代细胞Hep-2和病毒作用分为三组：

（1）实验对照组y1，只加病毒，不加药

（2）先吸附，后加药组y2

（3）先加药，后吸附组y3

每组按照时间间隔2秒采集图像，得到各组的时间序列图像组，并利用荧光光谱分析系统对图像组进行分析：

1. 首先以两秒为时间间隔，分别对三组细胞图像进行采集，各采10幅图。
2. 然后对采集来的图像进行均衡化，平滑滤波以及高斯滤波。
3. 在滤波后的图像上选择目标区域，并将所选区域以及该区域对应的原始图像区域进行显示与保存。
4. 对图像进行阈值滤波，以减去细胞外的背景信息。
5. 求得阈值滤波后细胞的像素面积。
6. 分别比较三种情况下细胞面积的变化。
   
             

图５　Hep-2细胞抗病毒显微光谱分析

如图5所示，可以发现细胞在只加入病毒，和同时加入病毒和药物两种情况下变化趋势是不同的。前者，细胞在形态上没有明显的变化，而后者细胞在形态上都存在较大变化，呈变大的趋势。因此，可以认定加入栀子提取物对病毒的抑制作用很明显。

2．茶叶荧光性绿斑病的研究

在日照、临沂和泰安等地、市的茶园中，普遍发生一种茶树成叶病害，其主要症状表现为：叶片下表皮局部异常凸起，呈绿色，而且病斑处在光照下能发绿色荧光，如图6所示。

图6  茶叶的绿斑病

通过对病害症状演化的系统观测发现：此病害具有发绿色荧光的特性，且随病害程度的加重，荧光增强，容易与其它一般病害的症状区分开来。所以，掌握和利用这一特性可以帮助我们正确辨认此种病害。我们选定其中一病变区域的荧光测定光谱如图7。

图7   病变区荧光光谱

总结

显微荧光光谱成像技术是显微光谱成像技术中一种常用的方法，对于能够产生自体荧光和激发荧光的物质来说，显微荧光光谱成像技术具有显著的优势，包括无创性，可视性，精确性等特点。

本文基于LabVIEW软件构建的显微荧光光谱分析系统，实现了数字图像采集、图像处理及生物医学中光谱图像分析等功能。系统功能结构复杂，所有工作在一年时间内完成，相比MSDN来说，大大节约了开发时间，且界面清洁美观、操作方便。